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Ni亲和层析主要用于带组氨酸标签（His-tag）重组蛋白的制备与纯化，是生物医药、酶制剂等领域中最常用的金属螯合亲和介质之一。目标蛋白通过基因工程在N端或C端引入6–10个连续组氨酸残基，纯化时首先发生特异性吸附：在适当pH条件下，组氨酸残基的咪唑环与固定化Ni²⁺形成配位键，将目标蛋白“捕获”于层析柱上；随后进行竞争性洗脱，利用咪唑作为组氨酸类似物，缓冲液中高浓度咪唑与His-tag竞争结合Ni²⁺，将目标蛋白从柱上置换下来，实现洗脱。

凡涉及His-tag重组蛋白的制备场景，几乎都离不开Ni亲和层析。其凭借高载量、操作简便、耐受性强等优势，已成为蛋白纯化中最通用的“第一道”捕获步骤。然而在实际操作中，从“挂柱”到“洗脱”的每个环节均可能遇到问题。U8集团根据实际经验与客户常见疑问，整理出以下解答及相关建议。

常见问题解答（FAQ）

Q1· 样品不挂柱

可能是样品本身His标签丢失，导致无法与Ni离子结合；

样品的pH值或电导会影响结合力，可尝试调节缓冲液上样条件，优化结合效果。

Q2· 样品洗脱纯度不高

可在缓冲液中添加200-500 mM的盐，屏蔽Ni离子的静电作用，减少杂蛋白结合；

增加一步低浓度咪唑洗杂步骤，去除大部分结合力较弱的杂蛋白。

Q3· 柱子用久了怎么清洗

对于NTA Ni填料，建议先脱镍后对柱子进行彻底清洗；Ni Excel填料无需脱镍，可直接清洗；

可使用高浓度碱、盐酸胍或30%异丙醇等试剂进行清洗，确保清洗彻底。

Q4· Ni Excel用久了，载量下降了需要补镍吗

一般情况下无需补充镍离子，除非料液中含有EDTA，会导致镍离子缓慢脱落，若长期使用后载量下降明显，可直接补充镍离子，载量可恢复至一定水平。

Q5· 咪唑洗脱后的样品，后面进行精纯处理，咪唑残留如何检测

U8集团可提供咪唑残留检测的完整工艺方案，采用SRT SEC-300 (5μm 300Å，4.6x300mm）色谱柱有效分析咪唑含量，助力解决精纯过程中的残留检测难题，如有需要欢迎详询。

Ni亲和填料

Agarosix MC90-NTA Ni和Agarosix MC90-Ni Excel是两款以6%高交联度琼脂糖为基质的金属亲和层析填料，填料表面具有高度亲水性，最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。

Agarosix MC90-NTA Ni填料以次氮基三乙酸（NTA）为配体螯合镍离子，His标签蛋白的载量高于50 mg/mL，可耐受0.1 M NaOH清洗再生。

Agarosix MC90-Ni Excel填料以三羧甲基乙二胺（TED）为配体螯合镍离子，5个螯合位点使得其对于镍离子具有很强的约束力，该填料可重复使用，无需补充镍离子，可有效缩短纯化工艺。详细技术参数可见表1。

表1. Agarosix MC90-NTA Ni和Agarosix MC90-Ni Excel的技术参数

Agarosix MC90-NTA Ni填料的蛋白载量高，耐酸耐碱，可耐受0.1 M NaOH清洗再生。适用于原核蛋白表达料液中不含EDTA、DTT等还原剂或螯合剂——重组蛋白、酶、生长激素类。

Agarosix MC90-Ni Excel填料具有优异的DTT和EDTA耐受性，可重复使用100 次以上，每次使用后可以直接用0.5 M NaOH溶液在线清洗，无需补充镍离子，且耐碱性能较好，使用寿命较长，可缩短纯化工艺，有效降低成本。适用于真核体系表达料液中含EDTA、DTT等还原剂或螯合剂——重组蛋白、酶、生长激素类。

详细的产品介绍及测试数据可查看往期推文：更高载量、更强耐受性的琼脂糖基质Ni亲和填料——U8集团助力重组蛋白亲和纯化！

订购信息

注：包装规格为1 L，5 L, 10 L, 50 L，预装柱规格为1 mL, 4.2 mL, 5 mL

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